周作人在“自白书”中为自己辩护道：“初拟卖文为主，嗣因环境恶劣，于1938年1月1日在家遇刺，幸未致命，从此大受威胁……以汤尔和再三怂恿，始出任伪北京大学教授兼该伪校文学院院长，以为学校可伪学生不伪，政府虽伪，教育不可使伪，参加伪组织之动机完全在于维持教育，抵抗奴化……”
1946年7月19日，南京高等法院对周作人案进行了第一次公开审理，《申报》报道了此次审理过程：“周逆作人十九日晨十时，在首都高院受审，历时二旬钟，以证据尚待调查，庭谕定八月九日再审。周逆昔日小有文名，今日旁听席上，特多男女青年。审讯前段，被告答复从逆前之经历，颇以二十年北大文科教授之任自傲。述其附逆动机；狡称：旨在‘维持教育，抵抗奴化’。庭长当斥以身为人师，岂可失节。周逆答辩谓：‘头二等的教育家都走了，像我这样三四等的人，不出来勉为其难，不致让五六等的坏人，愈弄愈糟。’并称，二十六年秋，留平不去，系因年迈，奉北大校长蒋梦麟之嘱为‘留平四教授’之一，照料北大者，惟对其二十八年之任华北政务委员会常委兼教育总署督办，以及东亚文化协议会会长，华北综合研究所副理事长，伪新民会委员，伪华北新报社理事等职，则期期艾艾，对答之间颇感尴尬，但仍东拉西扯，以二十八年元旦之被刺，‘中国中心思想问题’论战，以及胜利后朱校长家骅之华北观感等，作为渠有利抗战之证据，庭上当谕以证据颇确凿有力，当谕以为便收集，特宽限三星期再行公审，周逆乃于汗流浃背下狼狈还押。”
关于周作人所说受北大之托管理校产，法庭就此事询问了当年的北大校长蒋梦麟，蒋复信称确有其事。法庭还曾询问时任北大校长的胡适，胡复函称周在伪北大文学院长任内，保管图书很为周到，未受损失，并且有增无减。
宣判前，记者黄裳到南京老虎桥狱中访问周作人，其报道《老虎桥边看‘知堂’》写道：“一会儿，我在窗外看见一位狱吏带了一个老头儿来了。这是我第一次看见周作人，不过在印象中，是早已有了一个影了的，现在看看‘正身’，大抵差不多。他穿了府绸短衫裤，浅蓝袜子，青布鞋，光头，瘦削，右边庞上有老年人常有的瘢痕，寸许的短髭灰白间杂，金丝眼镜（这是他在一篇文章中提到过的‘唯一’的一副金器，三十年前的老样子）。”
周作人因卖国罪被判死刑，胡适等人使尽浑身解数，将他从枪口下夺回，他被判有期徒刑十四年，后改为十年，一直在南京老虎桥监狱服刑。在狱中三年多，他除了每日读书外，写了二百多首诗作，还翻译了英国劳斯所著的《希腊的神与英雄》。
周作人曾记录他在狱中的一些趣事：他所住的忠舍的一些富翁用钱贿络监狱看守人员，从外面带进来很多诸如烟酒之类的违禁物品，生活得十分惬意。其中有个老头，据说是曾经斗垮“红顶商人”胡雪岩的巨商盛宣怀的侄子，因贩鸦片积聚了些钱财，他将全舍上下从狱卒到所长通通打点了一遍，所以忠舍里的人都叫他“老太爷”。周作人经常找一个杀人犯帮他理发，此人因斗殴误杀一人被判死刑，后改有期。“把头颅托付于他，没有觉得什么不放心的，叫一个杀人犯来剃头，当初一听却是骇人听闻的了”。
1949年元旦，周作人经友人保释出狱，离开时，周作人作诗云：“一千一百五十日，且作浮屠学闭关，今日出门桥上望，菰蒲零落满溪间。”